1. 目的

建立operetta CLS型共聚焦高内涵成像分析系统的标准操作程序，确保测量结果的可靠性。

2. 适用范围

对operetta CLS型共聚焦高内涵成像分析系统的操作。

3. 责任

操作工对该规程的实施负责、生产管理人员对本规程的有效执行承担监督检查责任

4. 注意事项

4.1蓄电池一般不关机；

4.2主仪器左侧盖内有带条码的滤光片，禁止随意拿取；

4.3主仪器右侧盖内有废水瓶（Waste）、纯水瓶（Immersion），纯水瓶中的水为双蒸水或三蒸水（去离子水），此水瓶消耗量不大，切勿随意打开加水，以免污染。长时间不用水镜，需更换水瓶内的水（两周更换一次）；

4.4电脑主机后方连有带卡片的密码狗，切勿拔出，否则软件报废；

4.5添加新板型时，除裙边H、板底厚度I两个参数可由机器扫描得到，扫板时用20倍镜，且需将矫正环调节至0.5 mm，其余参数需提前跟厂家联系获取；新版型的命名方式为：孔板数量+品牌+货号（板型）；

4.6载板架只能通过软件操作打开，切勿手动打开；

4.7从冰箱取出的板需放至室温，确保板面无水珠再进行操作；

4.8上机前先在普通倒置显微镜下观察是否有细胞，通常选择4-5个视野进行拍摄，孔的边缘视野建议不勾选；

4.9该仪器所有命名均只能为英文和数字；

4.10孔板尽量避免使用最外圈，因为最外圈折射率不同，蒸发效率比内圈快；

4.11不要求把板盖取下来，但在进行明场拍摄时切勿在板盖上做标记；

4.12成像板分次使用时，在无菌条件下用封口膜封住后再取出进行拍摄，避免染菌；

4.13导出的图像标尺不可更改，建议在用到的每个倍镜下均导出一张带有标尺的图像，其余图像可参照该标尺进行设计；

4.14每次实验除保存处理好的图像外，还需对原始数据进行备份。

5. 操作规程

5.1 开机

• 打开电脑，电脑初始密码为Harmony。
• 打开主仪器左侧开关（绿色按钮），绿灯闪烁仪器自检开始，稳定成绿色自检通过；打开桌面Harmony 5.1软件，软件初始密码为PKI。
• 软件界面：Setup（参数设置）；Run Experimemt（运行程序）；Image Analysis（数据分析）；Evaluation（数据统计）；Eject（载板架按钮）；Settings（设置）：换镜头、CO2 浓度和温度、板型等。

5.2设置拍摄程序：（Setup）

点击软件左侧界面“New”，建立新的拍摄程序，“Plate Type”选择孔板类型（根据板类型不同，机器会自动提醒是否调节矫正环，例如薄板提示调节至0.19 mm，如需要调节则点击“Yes”，机器上盖自动打开，取下正上方镜头，切勿触碰镜头侧边条码，镜头边的黑线与0.17 mm的刻度对应，放入镜头时，镜头红点与转盘红点相对应，确认镜头与锁扣固定，盖上盖子），点击“Eject”，载板架升起，放入需进行拍摄的板，确保板与载板架之间完全扣住，点击“Autofous”自动聚焦，优先选择“Two Peak”，“Two Peak”无法聚焦时选择“One Peak”，点击“Objective”选择物镜，点击“Opt. Mode”选择拍摄模式：Non-Confocal为倒置荧光显微镜宽场模式，Confocal为共聚焦模式，Camera ROI和Binning为默认参数，无需设置；

软件右侧选择需拍摄的孔及拍摄视野，选中孔和视野后，点击“Select”，变为灰色即为选中的孔；若要取消孔和视野，选中后点击“Deselect”；点击“Channel Selection”，点击下拉箭头，点击“+”，根据染料选择通道：机器内置无目标染料名字时选择相应谱线即可；选择一个孔的一个视野，选中的孔和视野为黄色，点击所选通道下的“Snapshot”，看各个通道内是否有细胞；

5.3 聚焦

点击“Layout Selection”，“Plate”表示选中孔数，“Well”表示选中视野数，点击“Stack”进行层扫：“First Plane at”表示最低扫描层，“Number of Planes”表示扫描层数，“Distance”表示每层间隔μm数；进行层扫时取消“Well”对话框下的“Use in Test”勾选，则表示只对一个视野进行层扫，点击上方“Test”进行层扫聚焦；

点击右侧“Test Images”观察层扫结果，利用鼠标上下键选择最清晰的一层对应的μm数，返回“Stack”对话框，右击鼠标选中“Reset”取消层扫，返回“Channel Selection”在每个通道的“Height”输入选中的层扫μm数，每个通道的μm数不要求一致；

5.4调整曝光度和曝光时间

右键点击图像“Show Intensity”，点击图片最亮处，看数值是否超过65535，曝光太弱先将“Power”调至100%，再调“Time”，曝光太强则先调“Time”，再调“Power”，调整后再点击“Snapshot”聚焦，设置完成后，点击上方“Save”保存拍摄程序。

5.5 拍摄步骤：（Run Experimemt）

完成上述拍摄条件设置后，在“Plate Name”处命名，命名规则为：日期+操作者姓名+实验内容，设置好后点击“Start”开始运行程序，运行过程中右侧蓝色孔表示已经拍摄完成，可以点击进行观察，红色孔表示该孔未聚焦，红色孔过多时程序会自动停止运行。

5.6 图像导出：（Image Analysis）

点击“Measurement”后的“…”，选中“PKI”文件夹下已拍摄的图像，即可打开数据，通过图片右侧的操作区可选择图片成像形式，选中某种成像模式后，若图片太黑，点击“Flatfield Correction”下的“Basic”进行平场矫正，可拖动每个通道下的三个小箭头进行亮度、对比度、显示区间的调节，也可对“Color”的维彩颜色进行自主选择，点击选色对话框的“Set to Default”即可返回默认颜色，同时对话框内的“Palette”选项下可选择热图模式，图像参数调整完成后，右击图像选择“Save Image”即可保存图像。

5.7原始数据的导出与读取：（Settings-Data Management）

点击“Write Archive”，选择需要导出的数据（数据格式通常为Measurement），选择导出路径，点击“Start”即可；点击“Read Archive”，选择路径和数据即可读取数据；

点击“Export Data”进行数据导出，下拉“Method”选中“Measurements-Incl.Associated Files”即可保存灰色原图；选中“Evaluation Results per Well”即可保存孔板均值；选中“Evaluation Results per Well and Object”即可保存单个孔数据。

• 关闭仪器：关闭软件，关闭电脑，关闭仪器按钮。