1. 目的

建立实时荧光定量PCR系统的标准操作程序，确保测量结果的可靠性。

2. 适用范围

适应于实时荧光定量PCR系统的操作。

3. 责任

操作人员对该规程的实施负责、生产管理人员对本规程的有效执行承担监督检查责任。

4. 注意事项

• 购买与仪器匹配的耗材(八联管、PCR管等)，购买时可跟产家说明仪器的型号，确保可以使用再购买。(仪器型号:Pangaea4)(注意购买透明盖，因为仪器是顶部采集信号)
• 使用八联管时，请对称放置，确保热盖压力均匀。
• 放入样品前确保盖子盖紧、压实，以免卡机。
• 仪器在使用过程中，不要进行数据分析，以免使仪器运行异常。
• 数据用专用U盘考取，用完及时归还，做好借用登记，禁止使用私人U盘。
• CqMANs软件在线版本：（复制链接到浏览器即可使用软件）

http://cycloud.tpddns.cn:8888/CqMANs/build/index.html#/

• 实验结束:

（1）取出样品(不允许将样品留在仪器内)，关好仓门；

（2）断开联机；

（3）关闭软件，关闭电脑；

（4）关闭仪器电源，拔下插头；

（5）盖上防尘罩；

（6）登记仪器使用记录。

• 电脑桌面存有《使用指南》和《操作视频》，供大家查看。
• 注:不得无故拖延反应开始的时间，如无故拖延超过半小时，该时间段即刻取消，其他同学可协商使用。开启设备电源开关时谨防触电。
  5. 操作规程

&nbsp5.1  开关机

打开主机电源开关，长按正面待机键，“滴”一声后松开按键，主机启动并进行自检。如果关机需要先关电脑，待电脑关闭完成之后，在关闭仪器的主电源。

• 2  启动CqMan软件

启动CqMANs软件，进入默认adimin账户。

• 3  新建实验

点击“新实验”，进入实验设置界面。

5.3.1  连接主机

待软件自动识别到主机后，点击导航栏左边的红色按钮，按钮由红变绿，即说明软件与主机连接成功。

5.3.2  实验设置

根据自己实验要求设置实验信息，包括实验名字、实验类型、试剂类型（染料法或探针法）、运行模式选择标准默认设置。

• 4  程序设置

点击左侧导航栏的“程序设置”，按照对应的实验条件修改温度直接编辑输入。反应体积默认25 µL，如果需要其他体积，需要输入正确的体积。 Cover Temp默认105 ℃； Lid Close Temp默认30 ℃。通道选择按照自己试剂采集通道勾选。

• 5  孔板设置

点击左侧导航栏的“孔板设置”，进行孔板布局的设置。

5.5.1  目标基因设置

点击“添加”，添加空白行，即可添加基因信息。名称栏中输入基因名字；颜色栏可修改颜色；通道栏可选择荧光染料通道。

5.5.2  基因设置

选中左边孔位后，在各个基因的选择栏打√、表示该孔位包含此基因；取消√，则表示取消该孔位的基因设置。

5.5.3  实验样本设置

实验样本设置和上述基因设置一样。

5.5.4  标准曲线的设置（如需要请参考如下步骤，不需要设置标曲可忽略）

① 选中孔位，设置孔位中的目标基因，无需进行实验样本的设置步骤，直接在标准栏中操作；

② 名称栏中输入标准品的名称+序号，默认STD-1；标准品数目中输入标准品的数量，默认5；起始浓度中输入起始量，默认10⁸；单位选择标准品浓度单位，默认copies/µL；倍比稀释中选择稀释倍数，默认10x；重复数中输入重复数，默认3；排布方式中表示排列方式，包括竖列重复设置，横行重复设置和手动设置；升序和降序表示标准品浓度按照增序或降序排列。

③ 以上信息确认无误后，选中孔位，点击“应用”按钮，即完成标曲的设置。

• 6  运行设置

点击左侧导航栏的“实时运行"，点击开始，即可运行实验。

• 7  结果分析

5.7.1  定量分析界面

① 实验运行结束后，自动跳转至数据分析界面。同时在“下载”文件夹中自动生成包含所有数据的.cqa文件；

② 在定量分析界面可查看曲线扩增和CT值；

③ CT值数据导出：点击右上角导出即可获得excel表格，保存路径在下载文件夹。

5.7.2  数据分析熔解曲线界面(不需要查看可忽略)

点击熔解曲线界面显示熔解曲线的原始图谱和导数图谱，主要看引物特异性，单峰引物特异性较好。

5.7.3  基因表达柱状图界面(不需要查看可忽略)

① 实验设置勾选内参基因，样品设置勾选对照样品，柱状图即出，用于查看；

② 导出数据表格，选择右上角导出，勾选Gene Expression Data数据，即可导出数据表。

6. 参照

《实时荧光定量PCR系统使用说明书》